Современная аллергодиагностика: опыт работы

Вехи истории

Еще в 60-е годы прошлого столетия  было установлено, что реагиновые антитела, принимающие участие в защите организма от паразитов и в патогенезе аллергических заболеваний, принадлежат к отдельному классу иммуноглобулинов – классу Е. С тех пор остро встал вопрос о создании коммерческих диагностических тестов для их определения.

В те годы уже существовала технология получения иммуносорбентов на основе активированных бромцианом полисахаридных носителей, был разработан радиоиммунный анализ, а в 1971 г.  описан и иммуноферментный анализ. В научных исследованиях того периода в области биохимии (освоение аналитических и сепарационных методов) принимали активное участие шведские ученые. Один из них – J. Porath – является разработчиком сефадексов  (ионообменные полимеры декстрана) и разделения белков по молекулярным массам гельфильтрацией. Тесное сотрудничество с ведущими специалистами дало возможность компании Pharmacia (Швеция) стать пионером в области аллергодиагностики и в 1972 г. выпустить наборы для определения общего IgE, а в 1974 г. – специфических IgE (Phadebas RAST – радиоиммунный анализ, выполняемый на бумажных дисках).

В настоящее время компания Pharmacia, сохранившая свои лидирующие позиции в области аллергодиагностики, присутствует на рынке под брендовым названием Phadia. Разработанная специалистами этой компании инновационная технология ImmunoCAP является референсной в области анализов in vitro.

Началом создания MAST-CLA теста (множественного аллерго-сорбентного теста с хемилюминесцентным окончанием), который  сейчас производится под торговой маркой CLA-тест, следует считать 1976 г., когда в США был зарегистрирован первый патент В. Маринковича на использование целлюлозных нитей для множественного иммуноанализа.

Затем в 80-е годы появилась серия патентов компании Mast Medical Industries, уточняющих способ иммобилизации аллергенов и конструкцию панели.

В 1990 г.  компанией Mast Immunosystems была подана заявка на использование красителя для поглощения фонового излучения в составе субстратной смеси (применяемой для хемилюминесцентного определения активности маркера пероксидазы), что фактически и завершило создание технологии анализа. Начинание оказалось перспективным, и в 2000 г. компания влилась в концерн Hitachi и стала именоваться Hitachi Chemical Diagnostics.

Найденное удачное решение без принципиальных изменений использовалось до 2007 г., когда были запатентованы панели с иммобилизацией аллергенов на активированные облучением полистироловые элементы. Аллергопанели такой конструкции (гидродинамика была рассчитана на компьютере) отличались также использованием полимерных фокусирующих излучение линз и вставками-экранами для предотвращения взаимной засветки смежных элементов. Эти особенности позволили значительно повысить эффективность стадий промывки при смене реагентов. По данным литературы, измерению не препятствует присутствие в пробе миеломного IgE в концентрации до 10 000 МЕ/мл. иИмерения считаются достоверными при концентрации общего IgE в сыворотке крови до 2500 МЕ/мл.

Главная же идея осталась прежней – элементы с иммобилизованными аллергенами размещены в едином проточном корпусе, что позволяет легко и быстро проводить смену реагентов даже в ручном режиме, используя для регистрации результатов сравнительно недорогой настольный люминометр CLA-1.

Личные наблюдения

Вот уже около 10 лет, как мы работаем с аллергопанелями производства Hitachi Chemical Diagnostics. В клинике при НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина лечат больных, страдающих аллергическими заболеваниями, что позволяет сопоставлять результаты анализов с клиническими проявлениями, при необходимости проводить кожные пробы и дополнительные исследования с использованием аллерготестов других производителей (табл. 1).

Диагностические наборы CLA реализуются по всему миру в виде адаптированных к местной флоре и продуктам питания региональных панелей. В РФ с 1998 г. официальным дистрибьютором продукции Hitachi является компания «Люминери». У коллег из США мы выяснили, что цена аллергопанелей одинакова и в Калифорнии, и в Москве. В медицинских учреждениях российской столицы диагностика проводится с использованием 5 панелей, из которых три содержат 36 аллергенов, а две – 16. По чувствительности они сравнимы со скарификационными тестами.

Следует отметить, что гемолизированные сыворотки повышают уровень фонового сигнала, что характерно для анализов с использованием пероксидазной метки. Липиды в сыворотке несколько снижают сигнал. При повышении уровня общего IgE, начиная примерно с 500 МЕ/мл, растет и фоновый сигнал. При уровнях общего IgE более 1000 ед/мл во многих случаях возникает необходимость увеличивать время инкубации с субстратом для тушения фонового излучения (при хемилюминесценции суммарный сигнал со временем не нарастает). В противном случае у клинициста может сложиться ложное впечатление, что у больного имеется аллергия на все аллергены, представленные в панели.

Диапазон метода недостаточен для определения высоких концентраций IgE при наличии тяжелой атопии. Дело в том, что для выявления профиля сенсибилизации необходим повторный анализ разведенной сыворотки, а это для большинства больных неприемлемо по финансовым соображениям.

К достоинствам метода следует отнести стандартное качество диагностикума. Даже если сыворотку после анализа подвергнуть глубокой заморозке, то, разморозив ее через 5 лет, при проведении анализа можно воспроизвести первоначальный результат.

Также удобно  повторное использование инкубированной в панели сыворотки для каких-то уточняющих анализов в случае невозможности ее повторного забора (например, при ее курьерской доставке).

При работе на АР 1800 используются панели однотипной с методом CLA конструкции на 20 и 30 распространенных аллергенов. Однако значительное сокращение времени анализа, видимо, подразумевает увеличение емкости иммуносорбента за счет либо  более высокой степени активации носителя, либо использования дополнительно очищенных препаратов аллергенов. Увеличение емкости косвенно подтверждается увеличением регистрируемого светового потока для всех классов концентрации IgE.

В панелях для АР 1800 также в дополнение к нитям контроля реагентов и фона добавлена нить контроля заполнения сывороткой. За 6 часов работы АР 1800 позволяет проанализировать 50 сывороток, при этом предусмотрена возможность использования различных по количеству аллергенов панелей.

Анализ полностью автоматизирован, начиная с момента зарядки автоматического люминометра реагентами, панелями и сыворотками больных (маркированы штрихкодом).

Нельзя признать удачным ограничение прав оператора в планировании режима проведения анализа, который проводится на всех этапах по единому протоколу, тем более что в более высокой емкости часто  увеличивается неспецифическое связывание. В этом можно убедиться, ознакомившись с англоязычным руководством по эксплуатации прибора. В нем приводятся результаты анализа с использованием 30-аллергенной панели. Для двух аллергенов концентрация IgE классифицируется как «очень высокая», для восьми – как «высокая», а для остальных двадцати – как «умеренная». Выраженную сенсибилизацию к 30 аллергенам следует поставить под сомнение до подтверждения результата иным методом.

Остается надеяться, что проблема ложноположительных реакций будет успешно решена с появлением панелей OPTIGEN, опыт эксплуатации которых пока невелик. В настоящее время компания «Люминери» предлагает единственно доступный на рынке 20-аллергенный вариант.

Клинический случай

Важность устранения неспецифического связывания иллюстрирует недавний клинический случай. В клинику при институте поступил ребенок 12 лет, больной муковисцидозом. В случае этой патологии риск развития аллергического бронхолегочного аспергиллеза (АБЛА) составляет в среднем 10%. Концентрация общего иммуноглобулина  Е в момент поступления составила 475 МЕ/мл, из бронхоальвеолярного лаважа был высеян A.fumigatus. В сыворотке крови определялись специфические IgG.

Для диагностики было необходимо показать отсутствие или наличие специфических IgE. Пациент принимал гормональные препараты, поэтому определение наличия и степени сенсибилизации, а также атопии  проводили с использованием СLA-панели RIV. Анализ выявил «очень высокую» концентрацию IgE к пыльце деревьев и трав, некоторым пищевым компонентам. К остальным аллергенам панели концентрация IgE была определена как «умеренная». Анализ провели повторно с панелью ингаляционных биотинилированных аллергенов производства Radim и «Алкор Био».

Результаты подтвердили сенсибилизацию к пыльце березы и трав и показали «низкий» уровень IgE к пыли и аспергиллу. Для остальных 5 совпадающих в панелях аллергенов (класса «умеренный» в CLA-панели) специфические IgE обнаружены не были.

Такая аномальная сорбция сыворотки в CLA-панели в общем не является типичной, она определялась либо индивидуальными особенностями сыворотки пациента, либо была присуща данной патологии. По результатам консилиума больному диагноз аллергического бронхолегочного аспергиллеза (АБЛА) выставлен не был , антимикотическая терапия не  назначалась, так как все зарегистрированные в нашей базе случаи этого заболевания характеризовались более выраженной сенсибилизацией к причинному аллергену.

Больной в дальнейшем будет проходить ежегодное обследование с определением уровня микогенной сенсибилизации. Если он возрастет, вопрос о назначении антимикотиков будет рассмотрен повторно.

Выводы

Исходя из вышеизложенного, можно рекомендовать аллергопанели с иммуносорбентом на основе целлюлозы для выявления причинных аллергенов при невысокой и средней степени атопии (аллергический ринит, большинство случаев бронхиальной астмы, крапивница и ангиoотек с повышенной концентрацией общего IgE).

При атопическом дерматите с высокой концентрацией общего IgE и при необходимости выявления невысоких уровней сенсибилизации к диагностически значимым аллергенам на фоне тяжелой атопии следует использовать методы, менее чувствительные к неспецифическому связыванию.

Отдельно стоит вопрос о том, что лучше использовать – отдельные аллергены или сформированные производителями на основе рекомендаций врачей панели аллергенов. Аллергологам для успешного лечения пациентов, безусловно, удобнее применять панели, так как наблюдения показали: по результатам анамнеза ошибка  при выявлении причинных аллергенов составляет около 50%. Что предпочтительнее – количественные или полуколичественные методы анализа? Несомненно, количественные, ведь они позволяют лечащему врачу сопоставлять результаты, полученные в разное время, различными методами и в разных лабораториях.

Однако в настоящее время сравнительные испытания различных аллерготестов, калиброванных на основе стандарта ВОЗ, демонстрируют их существенные различия, причем зависящие от выбранного для сравнения аллергена. Для тестов ImmunoCAP соответствие результатов анализа калибровке по стандарту IgE ВОЗ строго доказано лишь для аллергенов пыльцы тимофеевки (причем для невысоких значений концентрации общего IgE).

В процессе работы с аллергопанелями нами выявлялась хорошая корреляция (в пределах одного класса – в зависимости от аллергена) с результатами аллерготестов Allergopharma (аллергодиски), аллерготестов с биотинилированными аллергенами Dr. Fooke, «Алкор Био» (Radim). Никакого соответствия не обнаружено с наборами аллергодиагностики производства ПО «Аллерген». Причем при анализе сыворотки больных, у которых в сторонних лабораториях были выявлены «высокая» и «очень высокая» степени сенсибилизации (судя по тестам на ставропольские аллергены), к отдельным аллергенам никакой сенсибилизации не обнаруживалось ни аналитически, ни клинически.

Особенности современных аллерготестов

• Нижний предел диагностически значимых концентраций специфических IgE в сыворотке крови составляет около 1 нг/мл (примерно 0,42 МЕ/мл).

• Низкие концентрации определяют основную особенность аналитических методик – обязательное использование иммуносорбентов высокой емкости.

• В качестве материалов применяют характеризующиеся развитой поверхностью активированные целлюлозные (ImmunoCAP, Phadia; MAST-панели Hitachi Chemical Diagnostics), нитроцеллюлозные мембраны, обладающие высокой сорбционной емкостью (иммуноблоттинг RIDA®AllergyScreen, R-Biopharm; аллергодиски, выпускающиеся большинством производителей средств для аллергодиагностики), традиционный для иммуноферментного анализа полистирол, в ряде случаев активированный облучением, в виде лунок планшетов (Dr. Fooke, Radim, «Вектор-Бест», «Алкор Био»  и т.д.), шариков (Immulite, Siemens), стеклянные, активированные силанизирующими реагентами слайды (ISAC, Phadia).

• Для повышения чувствительности анализа применяют в основном ферментные метки – пероксидазу, фосфатазу, бета-галактозидазу с фотометрической, а в ряде случаев – люминометрической (СLA-панели Hitachi Chemical Diagnostics, Immulite, Siemens) или флуориметрической детекцией (ImmunoCAP, Phadia).

Сравнение аллерготестов Hitachi трех поколений

Источник: