Наследственная и спорадическая формы рака толстой кишки

Генетика, как правило, изучает наследственность и изменчивость – две стороны одних и тех же основных жизненных процессов. Что касается РТК, специалисты в области генетики анализируют наследственные (герминальные) мутации в генах предрасположенности и характеризуют изменения в опухолевых клетках, в т. ч. соматические мутации в генах, участвующих в канцерогенезе. Эти задачи мы выполняем в молекулярно-генетической лаборатории, созданной на базе ГНЦК, применяя в основном такие молекулярно-генетические методы, как выделение ДНК и РНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР), полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ), электрофорез в полиакриламидном теле, секвенирование (по Сенгеру) и секвенирование нового поколения (NGS).

Выявить мутацию помогает электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов ДНК методом CSGE (рис. 1). Появление при исследовании лишних полосок свидетельствуют о наличии каких-либо изменений во фрагменте ДНК. Затем проводится секвенирование, позволяющее получить более точную информацию, например, о выпадении (делеции) в кодирующей области двух нуклеотидов (рис. 2).

При наследственных формах РТК с точки зрения генетики определяются два его основных синдрома:

• наследственный неполипозный рак толстой кишки (ННПРТК). История его открытия связана с именем американского ученого Г. Линча, который в 1966 г. описал 2 семьи на западе США, где в нескольких поколениях встречались больные РТК в сочетании со злокачественными опухолями желудка и эндометрия. Данное наблюдение было названо «семейным раковым синдромом». Позднее описанный синдром был переименован в синдром Линча;
• семейный аденоматоз толстой кишки (САТК).

На долю РТК, обусловленного синдромом Линча, в РФ приходится до 3% всех случаев заболевания колоректальным раком (КРР). Проанализировав показатели заболеваемости КРР в России с учетом пенетрантности гена, можно предположить, что в стране синдромом Линча страдают около 100 тыс. человек всех возрастов. Эта патология характеризуется в мире преимущественно поражением правых отделов ободочной кишки. Также исследования демонстрируют, что при синдроме Линча высок риск развития рака желудка у обоих полов, рака тела матки и рака яичников у женщин.

Основные клинические критерии синдрома Линча опираются на стандартные Амстердамские критерии I (введены в 1991 г.), разработанные для всех моногенных, в т. ч. онкологических заболеваний. К ним относятся:

• молодой возраст возникновения заболевания (до 50 лет);
• наличие 3-х или более родственников с морфологически верифицированным РТК;
• заболевание КРР более чем в одном поколении;
• не меньше чем один из больных должен быть родственником первой степени родства по отношению к остальным двум;
• САТК должен быть исключен.

Амстердамские критерии II (модифицированы в 1999 г.) содержат дополнительный критерий – наличие трех или более родственников с ННПРТК-ассоциированными опухолями (рак эндометрия, тонкой кишки, желудка, яичников, уретры, почечной лоханки и др.).

В 2004 г. на международной конференции в американском городе Бетесда (Bethesda) приняты новые критерии синдрома Линча, которые опираются на те же клинические показатели, что и амстердамские, но при необязательном их выполнении (или молодой возраст, или первично-множественное поражение, или семейно-отягощенный анамнез). Но в то же время вводится понятие молекулярно-генетических критериев – повышенный уровень микросателлитной нестабильности (MSI-Н).

Синдром Линча обусловлен наследственной мутацией в одном из генов системы репарации неправильно спаренных нуклеотидов (mismatch-репарация – MMR) (рис.  3). Это гены MLH1, MSH2, MSH6 и минорные гены – PMS2, MLH3, PMS1. Наследование с неполной пенетрантностью (до 80%). Синдром Линча характеризуется аутосомно-доминантным типом наследования.

Поскольку в ДНК постоянно возникают какие-либо ошибки, один из типов повреждения – неправильно спаренные основания, то комплекс белков, кодируемых этими генами, постоянно мониторит целостность ДНК и исправляет ошибки. В случае наследственной мутации этот комплекс неэффективно работает, количество белка уменьшено, и таким образом происходит накопление уже соматических мутаций, которые, в конечном счете, достигают критического уровня и запускают процесс канцерогенеза.

Имеется международное сообщество, изучающее вышеуказанные ге­­ны – InSIGHT (www.insight-group.org). По его данным, во всех странах основная часть мутаций при синдроме Линча приходится на гены MLH1 (38%) и MSH2 (33%). Реже мутации встречаются в гене MSH6 (19%) и минорных PMS2 (8%), MLH3 (2%). По данным InSIGHT на апрель 2014 г., зарегистрировано более 3 тыс. уникальных герминальных вариантов в этих генах, но мутациями из них являются около 50%.

При диагностике синдрома Лин­­ча используются различные моле­куляр­но-генетические маркеры. В критерии Бетесда входит исследование на микросателлитную нестабильность при опухоли (micro­satellite instability, MSI): MSI-S (stable – стабильная) и MSI-H (high – высокая).

Опухоли при синдроме Линча в отличие от спорадических имеют повы­шенный уровень нестабильности (MSI-H). Но поскольку некоторые опухоли и в спорадических случаях также нестабильны, можно тестировать на соматическую мутацию в гене BRAF(V 600 E), которая никогда не обнаруживается при синдроме Линча, и, таким образом, при отсутствии BRAF-мутации рекомендована ДНК-диагностика самих генов MMR.

Что такое микросателлитная нестабильность? По всему геному у человека рассеяны микросателлитные пов­торы, они могут быть мононуклеотидными, динуклеотидными, и при нарушении системы репарации неспаренных нуклеотидов длина таких повторов, как правило, уменьшается вследствие того, что в них ДНК-полимераза часто ошибается, и эти ошибки не исправляются.

В лаборатории ГНЦК для выявления микросателлитной нестабильности мы применяем метод фрагментного анализа. В мировой практике, как правило, для такой диагностики используются 5 маркеров: BAT25, BAT26, NR21, NR24, NR27.

MSI-H является маркером синдрома Линча, по результатам анализа РТК подразделяют на 3 группы:

1. MSI-H, когда 2 и более маркеров нестабильны;
2. MSI-L (low, низкая) – 1 маркер нестабилен;
3. MSS (stable) – стабильные опухоли, когда все маркеры показывают нормальную длину. На практике опухоли MSI-L считаются ближе к микросателлитно стабильным.

Статус MSI-H может возникать в 2-х ситуациях:

• если это соматическая инактивация генов – нарушена система репарации MMR, часто ассоциировано с мутацией в гене BRAF или мутилированием;
• если это синдром Линча.

В ГНЦК за последний год выявлено 13 пациентов с синдромом Линча (мутации в генах MLH1, MSH2, MSH6). Была также проведена ДНК-диагностика 14 кровных родственников. Больше всего – 8 мутаций – было выявлено в гене MLH1. На рисунке 4 приведена схематическая структура такого гена: он состоит из 19 экзонов. Мутации обнаруживаются в разных экзонах. В гене MSH2 мы обнаружили 3 мутации: c.942+3A/T, p.K392X, p.K430X. Минорные мутации только две: p.E30R, p.1745N, они приходятся на ген MSH6.

Интересная мутация обнаружена в гене MSH2 – c.942+3A>T. Сам пробанд имеет отягощенный анамнез: с 42 до 60 лет у него последовательно возникли два случая РТК, рак предстательной железы, рак мочеточника. Помимо РТК в его семье были отмечены рак кожи и очень много случаев рака тела матки. Такая картина мутации типична для синдрома Мьюир – Торре (Muir-Torre), который является одним из вариантов синдрома Линча. Эта мутация очень часто вызывает такую клиническую картину.

В семье больных с синдромом Линча большинство случаев приходится на РТК, на 2-м месте по частоте встречаемости в России стоит рак желудка – в отличие от ситуации в других странах, когда в этих семьях, как правило, встречается рак тела матки. Семьи с синдромом Линча очень гетерогенны. Количество пораженных родственников в семье – от 1 до 11. Из 13 выявленных больных 3 не имели семейного отягощенного анамнеза. Количество опухолей в семье также сильно разнится – от 1 до 13. Среднее число опухолей на семью – 6,4 случая рака. Число видов рака превосходит число пораженных индивидуумов из-за первично-множественных опухолей.

На рисунке 5 представлена мутация в гене MSH2 в семье с самым отягощенным анамнезом, которая нам встретилась. В ней присутствует заболеваемость и раком тела матки, и РТК, и раком желудка. Пробанд – женщина 50 лет с РТК. У нее мы обнаружили мутацию p.K430X в гене MSH2. Затем мы протестировали ее сестру 55 лет, клинически здоровую, не предъявляющую никаких жалоб, также выявили мутацию. При колоноскопии у нее был обнаружен рак на II стадии. Провели ДНК-диагностику ее дочери 35 лет, клинически здоровой, не предъявляющей никаких активных жалоб, выявили мутацию, при колоноскопии также был выявлен рак на I стадии. Больные были успешно прооперированы, но высокий риск развития рака повторно у них остается.

Основные критерии мо­ле­ку­ляр­но-генетической диагностики синдрома Линча, применяемой в лаборатории:

• молодой возраст – для всех пациентов со спорадическим РТК в возрасте 43–50 лет необходимо исследование микросателлитной нестабильности в опухоли;
• для всех пациентов с семейно-отягощенным анамнезом необходимо исследование микросателлитной нестабильности в опухоли.

В случае MSI-H статуса опухоли проводится дальнейшая ДНК-диаг­нос­ти­ка генов MMR (MLH1, MSH2, MSH6).

Протокол ведения пациентов с синдромом Линча для здоровых носителей мутации:

• колоноскопия у здоровых носителей мутации (с 25 до 80 лет, 1 раз в 1–2 года);
• УЗИ тела матки;
• гинекологическое обследование.

Эти меры способствуют раннему выявлению опухоли и снижению риска смерти от рака. С пациентами, страдающими синдромом Линча и с диагностированным РТК, мы обсуждаем объемы оперативного вмешательства. Больному сообщается о снижении риска развития 2-й опухоли в толстой кишке при выполнении субтотальной колонэктомии. При этом до него необходимо донести информацию о значительном ухудшении качества жизни после операции.

Второй по распространенности синдром – САТК. Это тяжелое наследственное заболевание, характеризующееся поражением толстой кишки множественными аденоматозными полипами со 100% индексом их малигнизации. Клинически выделяют классическую и ослабленную форму САТК. Приблизительно 1% от всех случаев РКТ обусловлен этим заболеванием. При САТК высока частота развития других опухолей: десмоидов, эпидерматоидных кист, доброкачественных остеом, аденом верхнего ЖКТ, опухолей щитовидной железы и головного мозга.

В классических случаях в толстом кишечнике развиваются сотни и даже тысячи полипов, практически не остается здоровой слизистой. Их рост может начинаться уже с первой декады жизни. Средний возраст развития РТК у больных составляет около 30–35 лет. Лечение только хирургическое – полное удаление толстой кишки. У превалирующего числа больных заболевание обусловлено наследственными мутациями в гене АРС с аутосомно-доминантным типом наследования.

При ослабленной форме полипоза отмечается значительно меньшее число аденоматозных полипов – 20–100, но при этом риск малигнизации довольно высок, хотя отмечаются более поздние сроки возникновения и озлокачествления полипов. Для данной формы свойственен скудный семейный анамнез. Часть случаев заболевания связана с наследственными мутациями в гене АРС, а также в гене МYH с аутосомно-рецессивным (поражены обе хромосомы) типом наследования.

Существует корреляция генотип/фенотип при САТК (рис. 6). Классическая форма обусловлена наличием мутации в середине гена, 5’ немного сдвинут к концу. Она выделена красным – с 168-го кодона до 1250-го. Есть интервал более узкий (1464 –1580), что проявляется очень тяжелой формой заболевания. При ослабленной форме, наоборот, мутация располагается следующим образом: либо 5’ – в начале, либо 3’ – в конце.

При десмоидной болезни, когда наряду с полипами у больного наблюдаются множественные десмоиды, мутация расположена от 1395-го до 2000-го кодона.

Отобрано 73 образца крови больных САТК, наблюдавшихся в ГНЦК: 49 пробанда с классической формой; 24 – с ослабленной. Проведены ДНК-диагностика всех кодирующих экзонов генов APC и MYH и молекулярно-генетическое обследование кровных родственников в нескольких семьях, где у обследованных пациентов были выявлены мутации. У пациентов с классической формой полипоза (средний возраст – 26 лет, наследственность отягощена – больны двое родственников) хотя мутации встречаются de novo, возникают у самих пациентов, становящихся родоначальниками заболевания в семье) выявлена частота мутаций в гене АРС в 68,75% случаев.

Отмечаются различные мутации (рис. 7): преобладают мутации небольших делеций и вставки, нонсенс-мутации, мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания, мутация сай­та сплайсинга. Встречаются 2 частые мутации 1061del5 и 1309del5. 13 мутаций нами описаны впервые в России: в их числе р.Q260X, p.Y1183X, p.289del4, p.589del11, p.864delC, p.903del7, p.1100del4, p.1114delC, p.Q1191X.

На рисунке 8 представлена родо­словная пациента с классической формой полипоза (мутация с.646-1G>A). Мы обнаружили мутацию у пациентки (51 год) и потом протестировали ее детей, из которых только старшая предъявляла жалобы. Мутация обнаружена у всех троих, и они находятся под динамическим наблюдением в ГНЦК.

При проведении молекулярно-генетического исследования генов MYH и АРС у пациентов с ослабленной формой полипоза мутации обнаружены в 25% случаев (6/24). Большая часть приходится на ген MYH. В нем обнаружены варианты: p.D382D, p.G382D, 2 – p.G169D. В гене АРС обнаружен повторяющийся вариант миссинг-мутации p.I1307K.

Существует семейный КРР Х-типа, характеризующийся накоплением случаев РКТ в семье (риск развития рака толстой кишки умеренно высокий). Его клинические особенности: возраст возникновения рака более поздний – 50–60 лет, локализация рака – дистальные отделы, риск развития рака другой локализации при этом невысокий. Опухоли микросателлитно стабильны, наследственные мутации не обнаружены, экспрессия генов MMR нормальная. Генетическая природа на сегодняшний день неизвестна, в этом направлении будет вестись поиск.

Известны редкие синдромы с РТК, для которых известны генетические причины, мутации в генах, которые их вызывают: синдром Пейтца – Егерса (PJS) – STK11, синдром Коудена – PTEN, семейный ювенильный полипоз (FGP) – SMAD4, BMPRIA, MADH4, PTEN и синдром Ли – Фраумени – TP53. На эти формы с известной молекулярно-генетической причиной приходится до 5% всех случаев наследственных РТК. Помимо этого, еще встречается и семейный КРР Х-типа, но в этом случае мы пока ничем больным помочь не можем.

Что на сегодняшний день применяется при диагностике спорадического РТК? Изучаются соматические мутации в генах, микросателлитная нестабильность и изменение экспрессии генов и микроРНК опухоли.

При канцерогенезе меняются различные сигнальные системы, возникают мутации в большом количестве генов. На сегодняшний день такая картина трудна для интерпретации, в обычной практике мы можем изучать гораздо меньшее число генов.

В большинстве опухолей толстой кишки мутированы гены АРС и ТР53:

• KRAS – 35–45%;
• NRAS – 2–4%;
• BRAF – 5–15%;
• PIK3CA – 10–20%;
• AKT1, ABL1, MET, EGFR.

Один из достаточно изученных путей – EGFR-зависимый сигнальный путь. EGFR – рецептор эпидермального фактора роста. На сегодняшний день для колопроктологии он имеет большое значение, т. к. взаимосвязан с основными генами, изученными и диагностированными при КРР: KRAS, NRAS и BRAF. Чем они важны? При лечении метастатического РТК в России применяют таргетные препараты, являющиеся ингибиторами EGFR (цетуксимаб, панитумумаб). Эти препараты блокируют EGFR, и дальше сигнал от рецептора не передается по генному пути. А в случае наличия мутантных генов KRAS и NRAS происходит независимая активация этого пути. В этом случае препараты неэффективны.

Ген KRAS (40-45%) является как предиктивным, так и прогностическим маркером. Мутации располагаются в основном в 12-м, 13-м кодонах, реже – в 61-м, 117-м, 146-м кодонах. Наличие KRAS-мутации свидетельствует о худшем прогнозе. Ретроспективный анализ результатов лечения в исследованиях CRYSTAL и OPUS, проспективное исследование PRIME, учрежденное на большой выборке, доказали, что препарат цетуксимаб (антитела к EGFR) при добавлении его к химиотерапии на основе оксалиплатина обладает высокой эффективностью только при диком типе гена KRAS в опухоли. Наличие мутации в гене KRAS сопровождается резистентностью к таргетным препаратам цетуксимабу и панитумумабу. Препараты в таком случае неэффективны, они ухудшают прогноз и снижают выживаемость у пациентов.

На сегодняшний день изучается также ген NRAS (гомолог KRAS). Мутации NRAS в аденокарциномах толстой кишки происходят значительно реже – примерно в 5% случаев. Мутации заключены в 12-м, 13-м, 61-м кодонах. Мутации в NRAS аналогичны по своей предиктивной значимости мутациям в KRAS.

С 2009 г. за рубежом перед назначением этих препаратов обязательна оценка статуса KRAS (12-13 кодоны). В России в 2014 г. тоже планируется с этой целью ввести оценку статуса KRAS и NRAS (12, 13, 61, 146).

Ген BRAF: чаще всего мутации происходят в кодоне V600E (15-й экзон). Частота мутаций составляет 5–10%. Больные с мутацией в гене BRAF разделяются на 2 группы с противоположными клиническими характеристиками:

• BRAF -mut + MSI-H – благоприятный прогноз;
• BRAF-mut + MSS – очень плохой прогноз (эти опухоли резистентны и к антителам EGFR, и к стандартной химиотерапии).

Безрецидивная выживаемость значительно снижена. По данным исследования Roth А. et al. (JCO, 2010 г.), безрецидивная выживаемость на II и III стадиях РТК при наличии BRAF-мутации составила 7,5 месяца в отличие от 25,2 месяца при диком типе гена BRAF и отсутствии мутации. Существует таргетный препарат вемурафениб, который применяется при лечении меланомы. Но при РТК существование мутации V600 не дает достаточной чувствительности к вемурафенибу (нужно блокировать не только EGFR-сигнальный путь, но и входные пути). По-видимому, будет разработана схема при КРР, когда к вемурафенибу будут добавляться иные таргетные препараты.

Ген PIK3CA: большая часть мутаций в 20-м и 9-м экзонах, частота составляет 10–20%. Опухоли с мутацией в PIK3CA устойчивы к цетуксимабу. Но в 2012 г. в N Engl J Med были опубликованы результаты ретроспективного исследования «Применение аспирина при опухоли с мутирующим геном PIK3CA и колоректальный рак» (с участием 964 пациентов). В нем доказано, что при наличии мутантного гена PIK3CA прием аспирина достоверно увеличивает выживаемость больных. Данный эффект объясняется тем, что мутация в этом гене приводит к активации соответствующего фермента – фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат-3-киназы (PI3K), который активирует циклооксигеназу-2 (СОХ-2) и запускает пролиферацию, снижается апоптоз клеток. А аспирин – известный ингибитор СОХ-2.

Предсказательными маркерами при лечении антителами к EGFR являются цетуксимаб, панатумумаб. На рисунке 9 представлены результаты исследования, в котором участвовало несколько тысяч больных, получавших лечение этими препаратами. Ответили на стандартную дозу 22% пациентов, на увеличенную дозу – еще 5%, у остальных эффективности не наблюдалось. Чем это объясняется? В первую очередь мутацией KRAS (40%), в 10% случаев наблюдалась мутация BRAF, у части больных причиной резистентности стала потеря гена PTEN или мутация PI3K (процент неизвестен). В ряде случаев причина резистентности была неизвестна.

MSI-H опухоли не склонны к метастазированию, имеют благоприятный прогноз. Для метастатического РТК MSI-H отмечена более высокая эффективность терапии 5-фторурацилом и лейковорином.

В лаборатории мы занимаемся не только стандартной диагностикой мутаций, но и таким перспективным направлениям онкогенетики, как экспрессия определенных генов в опухоли. На мировом рынке достаточно много экспрессионных панелей, которые применяются как прогностические, с их помощью пытаются оценить чувствительность к различным препаратам по характеру экспрессии генов (метод ПЦР в реальном времени). Существует голландская система ColoPrint® – панель экспрессии 18 генов, которая очень хорошо идентифицирует пациентов с очень высоким и низким риском рецидивов на стадиях II / IIIА).

Мы очень заинтересованы в научной программе по изучению эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) в опухолях толстой кишки. Этот процесс приводит к тому, что клетки эпителия (эпителиальный фенотип опухоли толстой кишки) приобретают иной, мезенхимальный фенотип. При этом клетки становятся подвижными, способными к инвазиям. На сегодняшний день предполагается, что ЭМП является механизмом метастазирования при КРР.

На рисунке 10 представлен ряд генов, по характеру экспрессии которых мы точно можем диагностировать опухоли, в которых процесс канцерогенеза запущен. Они характеризуются определенными маркерами мезенхимального типа и супрессии в генах эпителиального типа. Среди всех опухолей 16% I–III стадии ЭМП-позитивны, у них очень неблагоприятный прогноз. Исследуя РТК, осложненные перитонеальным канцероматозом – наиболее агрессивным метастатическим поражением, мы выявили, что 95% канцероматозных узлов у таких больных имеют мезенхемальный подтип, они ЭМП-позитивны.

Экспрессивный анализ микроРНК в опухолях толстой кишки показал, что повышенная экспрессия miR-155 и miR-21 ассоциирована с метастатическим поражением.